Задачи исследований лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии

• Определить регуляторные и метаболические механизмы нарушения функциональной активности клеток иммунной системы при онкологических заболеваниях и на их основе разработать методы молекулярно-клеточной терапии и иммунореабилитации.
• Исследовать метаболические механизмы нарушения функциональной активности клеток иммунной системы при инфекционно-воспалительных, аллергических и аутоиммунных заболеваниях и на их основе разработать новые методы диагностики и прогноза характера течения и исхода заболеваний.
• Изучить регуляторно-метаболические механизмы иммунных и воспалительных процессов в генезе основных неинфекционных заболеваний и разработать новые методы и технологии оптимизации их профилактики, диагностики, лечения и реабилитации.
• Установить особенности иммуногенетических показателей у здорового европеоидного населения Красноярского края и у больных мультифакториальными заболеваниями во взаимосвязи с генотипами полиморфных вариантов генов провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.

Основные достижения лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии
На основе данных исследований разработана регуляторно-метаболическая концепция развития иммунопатологических состояний, что послужило базой для создания биохемилюминесцентного комплекса индивидуальных методов диагностики иммунометаболических нарушений и оценки воздействия различных лекарственных препаратов на клетки иммунной системы, а также методов прогноза характера течения и исходов различных заболеваний. Разработана концепция механизмов развития иммунодефицитных состояний при адаптации к климато-географическим условиям Крайнего Севера. Подробно исследован фенотипический состав клеток иммунной системы в крови у больных распространенным гнойным перитонитом, на основании чего зарегистрирован новый метод прогноза исхода данного заболевания. Разработана технология получения метаболически-индуцированной дендритноклеточной вакцины с высоким уровнем антигенпрезентационной активности для лечения и иммунореабилитации онкологических больных. Исследование распределения генотипов генов цитокиновой сети и генов белков противоинфекционной защиты организма у коренных национальностей Таймырского Долгано-Ненецкого района Красноярского края и в популяционной группе европеоидов Красноярского края выявили специфические генетические маркеры, позволяющие прогнозировать развитие и течение заболеваний.
Основные приборы и оборудование лаборатории клеточно-молекулярной физиологии и патологии

Автоматический биохемилюминесцентный анализатор БЛМ-3606М

Биохемилюминометр БЛМ-3606М предназначен для измерения сверхслабых световых потоков, возникающих в результате биохимических реакций на основе бактериальных и других люцифераз, а также при спонтаннойи индуцированной хемилюминесценции.
Технические характеристики:
Область спектральной чувствительности, нм 300 - 800
Объем измерительной кюветы, мл 1
Общее количество кювет, шт. 36
Количество рабочих кювет, шт. 35
Диапазон температуры кюветного отделения, С 20 -45
Динамический диапазон измерений 1 - 1000000
Время измерения одной точки биохемилюминесцентной
кривой, сек. 0,1 - 10
Время перехода между двумя рядом стоящими пробами,
не более, сек. 0,3
Общее время измерения биохемилюминесценции, мин 1 - 240
Число точек измерения на каждую биохемилюминесцент-
ную кривую 1 - 440
Количество каналов для подключения внешних дозаторов 4

Проточный цитофлуориметр NaviosTM (Beackman Coulter, USA)
(Центр коллективного пользования КНЦ СО РАН)

Проточный цитометр Navios™ – новейшая разработка в области проточной цитометрии, предназначенная дляпроведения клинических и научных исследований. Иммерсионные линзы, система оптического геля, волоконная оптика, широкий динамический диапазон регистрации сигналов и разрешение сигналов по 1048576 каналам обеспечивают высокую чувствительность и превосходное разрешение во всем рабочем диапазоне. Пространственно разделенные оптические пути позволяют проводить анализ практически без введения коэффициентов компенсации.
Основные технические характеристики:
1. Источники света:

• синий полупроводниковый диодный лазер, 488 нм, выходная мощность 22 мВт;
• красный полупроводниковый диодный лазер, 638 нм, выходная мощность 25 мВт.

2. Конфигурация оптической системы -пространственно разделенные пучки лазеров (лучи должны быть разведены не менее чем на 125 мкм).
3. Мощность лазерного излучения в проточной ячейке:

• синий – не менее 20 мВт;
• красный – не менее 20 мВт.

4. Проточная ячейка - прямоугольная кварцевая, 150 х 460 мкм.
5. Собирающая оптика:

• иммерсионные линзы 1,2 NA;
• система оптического геля.

6. Устройство оптического блока:

• открытая архитектура, позволяющая пользователю быстро заменить оптические фильтры для решения поставленной задачи;
• отражающая оптика с углом отражения 18°.

7. Детекторы:

• детектор светорассеяния в прямом направлении -полупроводниковый детектор на основе модели Фурье с возможностью изменения угла регистрации светорассеяния в прямом направлении (1-8° для регистрации частиц размером 8-40 мкм и 1-19° для регистрации частиц размером 0,5-10 мкм);
• детектор светорассеяния в боковом направлении -высокоэффективный фотодиод с независимой фокусировкой и электронным аттенюатором;
• фотоэлектронные умножители для регистрации флюоресценции (8 детекторов – FL1-FL8).

8. Фильтры детекторов, нм:

• светорассеяние в прямом направлении- 488;
• синий лазер- 526, 575, 620, 695, 755 для регистрации флуорохромов FITC, PE, ECD, PC5 или PEC5,5, PECy7;
• красный лазер- 660, 755 для регистрации флуорохромов APC или Alexa647, APCAlexa700, APCCy7, APCAlexa750;
• возможность замены пользователем детекторов и фильтров.

9. Регистрация светорассеяния и флуоресценции:

• одновременная регистрация 2-х параметров светорассеяния;
• до 8 флуорохромов одновременно, в том числе, синий лазер – не менее 5, красный лазер – не менее 3.

10. Чувствительность и разрешение:

• при регистрации светорассеяния прибор должен отличать частицы размером 0,404 мкм от фонового шума, максимальный размер частиц – не менее 40 мкм;
• пороговая чувствительность флуоресценции: не менее 112 MESF для FITC, не менее 78 MESF для PE, не менее 15 MESF для PC5, не менее 75 MESF для APC;
• динамический диапазон регистрации данных – не менее 6 декад.

11. Параметры цветовой компенсации - компенсация «всех против всех» (построение полной компенсационной матрицы), возможность ручного и автоматического введения коэффициентов компенсаций.
12. Виды получаемых сигналов и возможность их обработки:

• 5 различных сигналов от каждого детектора: площадь сигнала в линейной и логарифмической шкалах, пик сигнала в линейной и логарифмической шкалах, время детекции сигнала в линейной шкале;
• время и соотношение;
• возможность выбора до 62 параметров;
• формат данных - формат файлов FCS 3.0.

13. Обработка сигналов:

• динамический диапазон считывания данных (разрядность аналогово-цифрового преобразователя) – не менее 20 бит;
• разрешение рабочей станции (аналогово-цифрового преобразователя) – не менее 1 048 576 каналов;
• цифровая обработка с частотой не менее 40 МГц.

14. Максимальная скорость сбора данных – до 25000 событий в секунду.
15. Производительность:

• при анализе 10000 лимфоцитов – не менее 80 пробирок в час;
• на скорости считывания 10000 событий в секунду – не менее 88 пробирок в час.

16. Работа с образцами:

• низкая, средняя и высокая скорости подачи образца;
• расход обжимающей жидкости при считывании данных – не более 780 мл/час, перенос – менее 0,1%;
• наличие возможности работы с одиночными пробирками и с многопробирочным карусельным загрузчиком (не менее 32 позиций для пробирок 12 х 75 мм);
• автоматическое считывание данных для образцов рабочего списка;
• ручной режим для образцов рабочего списка;
• перемешивание образцов: запатентованный вортексный миксер, обеспечивающий перемешивание образца в каждой пробирке перед началом анализа;
• возможность считывания штрих-кода с карусели, позиции пробирки в карусели, а также штрих-кода отдельных пробирок перед началом анализа;
• автоматическая промывка прибора после завершения анализа каждого образца.

Проточный цитофлуориметр CytomicsTM FC-500 (Beackman Coulter, USA)

Проточный цитометр FC-500 позволяет максимально упростить выполнение исследований в области проточной цитометрии, повысить их эффективность и производительность. В проточном цитометре реализована передовая технология 5-ти цветного анализа с применением одного лазеров, что дает возможность увеличить информативность метода за счет анализа большего числа антител в одной пробирке. Кроме того, цитометр FC-500 имеет гибкую систему управления каждым аспектом цитометрического исследования с помощью новейшего программного обеспечения CXP.
Общая характеристика:
1. Основной источник света: цитометр содержит в качестве источника света синий (488 нм) аргоновый лазер с воздушным охлаждением. Стабильность и однородность луча газового лазера обеспечивает высокий класс измерений. При выходной мощности лазера 20 мВт чувствительность измерений оказывается достаточной для исследования даже слабо экспрессируемых клеточных маркеров. Пятицветный анализ в однолазерной модели реализуется с применением комбинации конъюгатов антител с флуорохромами FITC - PE - ECD - PC5 - PC7 различных производителей. Вместо PC5 можно использовать PerCP или PE-Cy5.5.
2. Оптическая схема: в цитометре FC 500 применена классическая «однолучевая» оптическая структура.
3. Блок спектрального разделения флуоресцентного сигнала: блок многоцветного анализа содержит пять оптических датчиков и систему фильтров и светоделительных зеркал. Оператор может легко заменить любое зеркало или фильтр с целью использовать иную комбинацию флуоресцентных красителей. Такая операция не требует перенастройки прибора.
4. Детектор переднего светорассеивания FS: размер клетки регистрируется по сигналу переднего светорассеяния (FS или ForwardScatter). От угла сбора рассеянного света существенно зависит то, какие классы клеток детектор будет хорошо разрешать. Диапазон углов сбора 1-8° оптимален для относительно крупных клеток - лейкоцитов, эритроцитов и клеток тканей. Диапазон углов 1-19° даёт возможность различать между собой гораздо более мелкие элементы.
5. Дискриминаторы и чувствительность: оптические и электронные схемы цитометра настолько чувствительны, что наряду с более или менее интенсивными полезными сигналами улавливают и огромное множество слабых мешающих сигналов, порождаемых, например, остатками разрушенных клеток (дебрисом). Для отделения таких незначимых сигналов в каждом измерительном канале цитометра (FS, SS, FL1-FL5) можно задать пороговый уровень - дискриминатор. Сигналы меньшего уровня будут восприниматься как незначимые.
6. Цифровая обработка сигналов и цветовая компенсация: сигналы фотодетекторов преобразуются в цифровую форму и далее обрабатываются цифровыми сигнальными процессорами (DSP). Такой способ обработки позволил повысить точность логарифмического преобразования. Но переход на цифровую обработку имеет и гораздо более важные последствия. FC500 - первый цитометр фирмы BeckmanCoulter, позволяющий вводить цветовую компенсацию по окончании сбора данных. Собранные данные сохраняются в файле формата FCS3.0. Если компенсация не была введена до сбора данных, её можно ввести в любое время. Если при анализе обнаружена ошибка, то компенсацию можно будет скорректировать не повторяя измерение на цитометре. Это особенно существенно, когда объём пробы очень мал.
7. Общая характеристика программного обеспечения: программное обеспечение для управления проточным цитометром функционирует в операционной системе Windows 2000. На управляющий компьютер устанавливается программа CXP Cytometer, предназначенная для управления цитометром и сбора и анализа данных, и программный продукт CXP Analysis, используемый для анализа цитометрических данных.

Проточный флуоресцентный анализатор Luminex™ 200
(ZeusScientific, USA) (Центр коллективного пользования КНЦ СО РАН)



Технология LuminexxMAP основана на использовании полистироловых микросфер (Ø 5,6 мкм). Микросферы окрашены двумя или тремя флуорофорами в различных соотношениях. Это позволяет получить до 500 типов микросфер, каждая из которых обладает уникальными спектральными характеристиками, т.е. имеет собственную «спектральную подпись». На поверхности микросфер каждого типа расположены флуоресцентные репортеры − реагенты, специфически взаимодействующие с исследуемыми маркерами (аналитами).
Проточный флуориметр LuminexTM 200 позволяет считывать спектральный адрес конкретной микросферы и сигнал репортерного флуорофора, интенсивность которого зависит от количества связавшегося аналита. Сигнал считывается от каждой индивидуальной микросферы (по принципу проточной цитометрии). Полученные данные суммируются в виде профиля аналитов в зависимости от спектрального адреса конкретной микросферы и репортера. Aнализ проводится в формате стандартного 96-луночного планшета с возможностью определения до 500 аналитов в каждой отдельной лунке планшета. Таким образом главным преимуществом мультиплексного анализа на основе технологии LuminexxMAP, как альтернативы ИФА, является возможность определения множества различных аналитов в образце.
Основные технические характеристики:
1. Точность и воспроизводимость:

• погрешность объема поглощения образца: ±5%;
• классификация микросфер: >80%;
• ошибка в классификации микросфер: ≤ 2%;
• температурный контроль: от 0°C до +2°C от установленной.

2. Оптика:

• репортный лазер: 532 нм, номинальная мощность: 10 - 15 мВт, максимальная – 500 мВт, диод с самоудвоением частоты, незатухающая волна (CW);
• классификационный лазер: 635 нм, 9,1 ± 6%, максимальная мощность – 25 мВт, диод, незатухающая волна (CW);
• репортный детектор: фотоумножитель, ширина полосы детекции: 565 – 585 нм;
• классификационный детекор: лавинный фотодиод с температурной компенсацией;
• чувствительность флуоресценции, минимальное регистрируемое количество молекул флуорохромафикоэритрина (РЕ) - 1000 молекул РЕ на одну микросферу;
• оптическая платформа: фиксированная, не требующая юстировки с пространственно разделенными оптическими путями разных лазеров;
• динамический диапазон световых детекторов: не менее 3,5 порядков для любого канала при линейном или логарифмическом усилении.

3. Жидкостная система:

• скорость обжимающей жидкости: 90 мкл ± 5 мкл/сек;
• проточная кювета: канал квадратного сечения шириной 200 микрон;
• скорость инжекции образца: 1 мкл/сек;
• объем обновления образца: 20 – 200 мкл.

4. Формат планшетов:

• 96-луночный формат;
• автоматический забор до 96 образцов;
• тип совместимых планшетов: плоскодонные, конические, круглодонные, фильтрационные;
• обнаружение и детекция флуоресценцентной эмиссии при 575 нм на поверхности от 1 до100 уникальные микросфер в одном образце.

5. Программное обеспечение: предустановленная программное обеспечение xPONENT 3.1.

 

 

Флуоресцентный спектрофотометр Agilent Cary Eclipse (Agilent Technologies, USA)

Сагу Eclipse-спектрофлуориметр с двумя сверхбыстрыми сканирующими монохроматорами, построенный на основе пульсирующей ксеноновой лампы и оптики Шварцшильда. Сагу Eclipse разрабатывался как спектрофлуориметр широкого профиля для проведения исследовательских работ и рутинных измерений, обладающий максимальной чувствительностью, скоростью и мощным пакетом программного обеспечения, превосходящим все современные аналоги.
Сагу Eclipse обеспечивает работу в режимах измерения флуоресценции, фосфоресценции, хеми- и биолюминесценции и дает возможность сбора 80 точек в секунду в режиме флуоресценции, что необходимо для изучения быстрых кинетических процессов. В режиме фосфоресценции сбор данных проводится каждую микросекунду. Чувствительность Сагу Eclipse позволяет определять пикомольные концентрации в пробах малого (0.5 мл в стандартной кювете) объема. Геометрия горизонтального пучка обеспечивает максимальную эффективность светоотдачи освещенной части пробы, а применение оптики Шварцшильда - максимальную эффективность использования источника света. Малые размеры (60 × 62.5 × 27.5 см) облегчают установку и работу прибора в лабораторных условиях, а большое кюветное отделение (19.8 × 27.3 × 20.5) позволяет без проблем устанавливать в прибор различные приставки и нестандартные образцы. Сагу Eclipse создан с применением полностью отражающей оптики с кварцевым покрытием. Как и во всех спектрофотометрах серии Сагу, оптические компоненты смонтированы на трехмерной стальной базе для повышенной стабильности при проведении измерений. В Сагу Eclipse используется пульсирующая ксеноновая лампа с продленным временем жизни, аналогичная источнику света спектрофотометра Сагу 60. Лампа включается только в момент сбора данных, что позволяет работать с фотолабильными пробами. Сочетание мощности светового импульса лампы со светособирающей оптикой Шварцшильда обеспечивает максимальную чувствительность прибора, повышает светоотдачу более чем в 100 раз и создает световую иммунность к комнатному освещению при открытом кюветном отделении. Высокая скорость сканирования позволяет собирать полный спектр менее чем за 3 секунды, экономит время исследователя и дает возможность изучения быстрых процессов. Встроенные турели с набором оптических фильтров, подбираемых программно или автоматически, максимизируют соотношение сигнал/шум и позволяют работать с пиками на втором порядке дифракции.
Основные технические характеристики:
Источник света пульсирующая Хе лампа
Ширина импульса 2 мкс
Эквивалентная мощность 75 кВт
Оптика Шварцшильда
Монохроматоры Черни-Турнера, 0.125 м
Дифракционные решетки 30 х 35 мм, 1200 линий/мм
Детекторы два ФЭУ R298
Оптический диапазон Возбуждение: 200-900 нм , Эмиссия: 200-900 нм
Спектральная ширина щели 1.5, 2.5, 5, 10 и 20 нм
Максимальная скорость сканирования 24000 нм/мин
Скорость сбора кинетических данных 4800 точек/мин
Время усреднения сигнала Флюоресценция: 0.0125 - 999 с,
Фосфоресценция: 1 мкс-10с,
Био/Хемилюминесценция: 40 мкс-10с.

Методы исследований

• Биолюминесцентный метод определения внутриклеточной активности NAD- и NADP-зависимых дегидрогеназ и концентрации основных интермедиатов и коферментов.
• Хемилюминесцентный анализ определения интенсивности и кинетики респираторного взрыва в фагоцитирующих клетках.
• Проточная цитометрия – метод регистрации оптических параметров клеток или частиц по сигналам светорассеивания и флуоресценции. Позволяет исследовать фенотип клеток с оценкой уровней экспрессии активационных и адгезионных рецепторов, а также содержание различных внутриклеточных молекул (внутриклеточные цитокины, транскрипционные факторы, регуляторные белки и т.д.).
• Молекулярно-генетические методы – полимеразная цепная реакция (ПЦР, RT-PCR), рестрикционный анализ фрагментов амплификации, электрофоретическая детекция.
• Мультиплексный анализ метаболитов в жидких средах организма invitro- мультиплексный анализатор белков и нуклеиновых кислот MagPix по технологии xMAP на магнитных микросферах позволяет определять до 50 метаболитов в микроколичествах образца.
• Иммуноферментный метод – определение содержания сывороточных общих и специфических иммуноглобулинов, провоспалительных и противовоспалительных цитокинов.
• Спектрофотометрический – определение показателей липопероксидации и факторов антиоксидантной защиты.

Направления исследований.

Задачи и достижения.

Основное оборудование.

Савченко Андрей Анатольевич
Заведующий лабораториейклеточно-молекулярной физиологии и патологии
Доктор медицинских наук, профессор
Контакты: +7(905)971-37-15,E-mail: aasavchenko@yandex.ru
Исследовательские интересы

• Иммунология,
• Медицинскаяиммунология,
• Физиология.

Краткая биография

Годы	Место, должность работы
16.06.1986г.	Томский ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт. Врач-биофизик. Диплом НВ № 524050
1986-1989 г.г.	Аспирантура в НИИ медицинских проблем Севера СО АМН СССР,
01.10.1996 г.	Заведующий лабораторией клеточно-молекулярной физиологии и патологии НИИ медицинских проблем СО РАМН

1990г. защита степени кандидата наук «Морфофункциональная характеристика лимфоцитов у часто болеющих респираторными заболеваниями жителей Крайнего Севера и Сибири», биофизика 03.00.02;
1996г. защита степени доктора наук «Этно-экологические особенности метаболизма лимфоцитов периферической крови при иммунодефицитных состояниях», патологическая физиология 14.00.16;
2005 г. аттестат профессора по специальности «Патологическая физиология».
Повышение квалификации:
- 1989 г. «Эксплуатация ПЭВМ. Основы программирования» (90 часов), Центр информатики Красноярского предприятия ВТИ;
- 2005г. «Естественно-научные основы современной медицины» (190 часов), КрасГУ;
- 2006 г. «Статистика» (234 часа), КрасГУ;
- 2007г. «Аспекты инновационной деятельности преподавателя ВУЗа» (72 часа), СФУ;
- 2008 г. Стажировка в университете Йорка (Торонто, Канада) по клеточной биологии;
- 2008 г. «Развитие иноязычной коммуникативной компетенции как основы успешного профессионального и межкультурного общения» (144 часа), СФУ;
- 2015 г. «Аллергология и иммунология» (144 часа), ФГБНУ «НИИ МПС».
- 2015 г. «Физиология, патологическая физиология» (144 часа) Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России.
- 2015 г. «Преподаватель высшей школы» ФГБОУ ВПО «Красноярский государственный педагогический университет им. В.П. Астафьева» Минобразования России.
- 2017 г. «Психолого-педагогическая деятельность преподавателя высшей школы в контексте стандартов нового поколения» (16 часов) ИПО ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.
- 2018 г. «Информационно-коммуникационные технологии в учебной и проектной деятельности преподавателя» (36 часов) ИПО ФГБОУ ВО КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздрава России.

Савченко А.А. автор 15 монографий, 4 учебных пособий, 30 авторских изобретений и патентов, более 200 статей в отечественных и зарубежных журналах. По данным РИНЦ индекс Хирша составляет 22, средневзвешенный импакт-фактор журналов 0,673, суммарное число цитирований по РИНЦ составляет 2223.

Под научным руководством и консультированием было защищено 35 кандидатских и 6 докторских диссертаций.